Wie die Polymerasekettenreaktion zur Amplifikation von Genen funktioniert

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine molekulargenetische Technik zur Herstellung mehrerer Kopien eines Gens und ist ebenfalls Teil des Gensequenzierungsprozesses.

Wie funktioniert die Polymerasekettenreaktion?

Genkopien werden unter Verwendung einer DNA-Probe hergestellt, und die Technologie ist gut genug, um mehrere Kopien von einer einzigen Kopie des in der Probe gefundenen Gens herzustellen. Die PCR-Amplifikation eines Gens zur Herstellung von Millionen Kopien ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung von Gensequenzen unter Verwendung visueller Techniken, die auf der Größe und Ladung (+ oder -) des DNA-Stücks basieren.

Unter kontrollierten Bedingungen werden kleine DNA-Abschnitte von Enzymen erzeugt, die als DNA-Polymerasen bekannt sind und komplementäre Desoxynukleotide (dNTPs) zu einem DNA-Stück hinzufügen, das als "Template" bekannt ist. Sogar kleinere Stücke von DNA, genannt "Primer", werden als Ausgangspunkt für die Polymerase verwendet. Primer sind kleine künstliche DNA-Stücke (Oligomere), gewöhnlich zwischen 15 und 30 Nukleotiden lang. Sie werden durch das Erkennen oder Erraten kurzer DNA-Sequenzen an den Enden des zu amplifizierenden Gens hergestellt. Während der PCR wird die sequenzierte DNA erhitzt und die Doppelstränge werden getrennt. Beim Abkühlen binden die Primer an das Templat (genannt Annealing) und schaffen einen Platz für die Polymerase, um zu beginnen.

Die PCR-Technik

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde durch die Entdeckung thermophiler und thermophiler Polymerase-Enzyme (Enzyme, die nach Erhitzen bei hohen Temperaturen die strukturelle Integrität und Funktionalität erhalten) ermöglicht.

Die an der PCR-Technik beteiligten Schritte sind wie folgt:

• Es wird eine Mischung mit optimierten Konzentrationen der DNA-Matrize, des Polymeraseenzyms, der Primer und der dNTPs erzeugt. Die Fähigkeit, die Mischung ohne Denaturierung des Enzyms zu erwärmen, ermöglicht die Denaturierung der Doppelhelix der DNA-Probe bei Temperaturen im Bereich von 94ºC.

• Nach der Denaturierung wird die Probe auf einen moderateren Bereich um 54 Grad abgekühlt, was das Annealing (Bindung) der Primer an die einzelsträngigen DNA-Matrizen erleichtert.
• Im dritten Schritt des Zyklus wird die Probe auf 72 Grad, die ideale Temperatur für die Taq-DNA-Polymerase, zur Verlängerung erhitzt. Während der Elongation verwendet die DNA-Polymerase den ursprünglichen Einzelstrang der DNA als Matrize, um komplementäre dNTPs an die 3'-Enden jedes Primers anzufügen und einen Abschnitt doppelsträngiger DNA in der Region des interessierenden Gens zu erzeugen.
• Primer, die an DNA-Sequenzen angelagert wurden, die nicht exakt übereinstimmen, bleiben nicht bei 72 Grad annealt, wodurch die Verlängerung auf das interessierende Gen beschränkt wird.

Dieser Vorgang der Denaturierung, Annealing und Elongation wird mehrere Male (30-40) wiederholt, wodurch die Anzahl der Kopien des gewünschten Gens in der Mischung exponentiell erhöht wird.Obwohl dieses Verfahren sehr mühsam wäre, wenn es manuell durchgeführt wird, können Proben hergestellt und in einem programmierbaren Thermocycler, der heutzutage in den meisten molekularen Laboratorien üblich ist, inkubiert werden, und eine vollständige PCR-Reaktion kann in 3-4 Stunden durchgeführt werden.

Jeder Denaturierungsschritt stoppt den Elongationsprozess des vorherigen Zyklus, wodurch der neue DNA-Strang verkürzt und auf ungefähr die Größe des gewünschten Gens gehalten wird.

Die Dauer des Verlängerungszyklus kann abhängig von der Größe des Gens von Interesse länger oder kürzer gemacht werden, aber schließlich wird durch wiederholte PCR-Zyklen die Mehrheit der Template auf die Größe des Gens von Interesse allein beschränkt sein. , wie sie aus Produkten beider Primer erzeugt worden sein werden.

Es gibt mehrere verschiedene Faktoren für eine erfolgreiche PCR, die manipuliert werden können, um die Ergebnisse zu verbessern. Die am weitesten verbreitete Methode zum Testen auf das Vorhandensein eines PCR-Produkts ist die Agarosegelelektrophorese. Welche wird verwendet, um DNA-Fragmente basierend auf Größe und Ladung zu trennen. Die Fragmente werden dann unter Verwendung von Farbstoffen oder Radioisotopen sichtbar gemacht.

Die Evolution

Seit der Entdeckung der PCR wurden andere DNA-Polymerasen als die ursprüngliche Taq entdeckt. Einige von ihnen haben ein besseres "Korrekturlesen" oder sind bei höheren Temperaturen stabiler, wodurch die Spezifität der PCR verbessert und Fehler durch die REPLACEion des inkorrekten dNTP verringert werden.

Einige Varianten der PCR wurden für spezifische Anwendungen entwickelt und werden nun regelmäßig in molekulargenetischen Labors eingesetzt. Einige davon sind Real-Time-PCR und Reverse-Transkriptase-PCR. Die Entdeckung der PCR hat auch zur Entwicklung von DNA-Sequenzierung, DNA-Fingerprinting und anderen molekularen Techniken geführt.