DNA-Amplifikation durch Polymerasekettenreaktion

PCR steht für Polymerase-Kettenreaktion, eine molekularbiologische Technik zum Amplifizieren von DNA-Segmenten, indem unter Verwendung von DNA-Polymerase-Enzymen mehrere Kopien unter kontrollierten Bedingungen erzeugt werden. So wenig wie eine einzelne Kopie eines DNA-Segments oder -Gens in Millionen von Kopien kloniert werden kann, was eine Detektion unter Verwendung von Farbstoffen und anderen Visualisierungstechniken ermöglicht.

Der 1983 entwickelte Prozess der PCR hat es ermöglicht, DNA-Sequenzierungen durchzuführen und die Reihenfolge der Nukleotide in einzelnen Genen zu bestimmen.

Die Methode nutzt thermische Zyklen oder das wiederholte Erhitzen und Abkühlen der Reaktion zum Aufschmelzen und Replizieren der DNA. Mit fortschreitender PCR wird die "neue" DNA als Matrize für die Replikation verwendet, und es erfolgt eine Kettenreaktion, wobei die DNA-Matrize exponentiell amplifiziert wird.

PCR-Techniken werden in vielen Bereichen der Biotechnologie angewendet, einschließlich Protein-Engineering, Klonen, Forensik (DNA-Fingerprinting), Vaterschaftstests, der Diagnose von erblichen und / oder infektiösen Krankheiten und zur Analyse von Umweltproben.

Besonders in der Forensik ist die PCR besonders nützlich, weil sie selbst die kleinste Menge an DNA-Evidenz verstärkt. PCR kann auch verwendet werden, um DNA zu analysieren, die Tausende von Jahren alt ist, und diese Techniken wurden verwendet, um alles von einem 800.000 Jahre alten Mammut bis zu Mumien aus der ganzen Welt zu identifizieren.

Das PCR-Verfahren ist wie folgt:

• Initialisierung: Dieser Schritt ist nur für DNA-Polymerasen erforderlich, die eine Heißstart-PCR erfordern. Die Reaktion wird auf zwischen 94 und 96 ° C erhitzt und für 1 bis 9 Minuten gehalten.

• Denaturierung: Wenn die Prozedur keine Initialisierung erfordert, ist Denaturierung der erste Schritt. Die Reaktion wird 20-30 Sekunden auf 94-98ºC erhitzt. Die Wasserstoffbrückenbindungen der DNA-Templates sind unterbrochen und es entstehen einzelsträngige DNA-Moleküle.
• Glühen: Die Reaktionstemperatur ist zwischen 50 und 65 ° C niedriger und wird 20-40 Sekunden gehalten. Die Primer lagern sich an die einzelsträngige DNA-Matrize an. Die Temperatur ist während dieses Schrittes extrem wichtig. Wenn es zu heiß ist, bindet der Primer möglicherweise nicht. Wenn es zu kalt ist, kann sich der Primer unvollkommen binden. Eine gute Bindung wird gebildet, wenn die Primersequenz mit der Matrizensequenz eng übereinstimmt.
• Extension / Elongation: Die Temperatur während dieses Schrittes variiert abhängig vom Typ der Polymerase. Die DNA-Polymerase synthetisiert einen völlig neuen DNA-Strang.
• Endgültige Verlängerung: Dieser Schritt wird 5-15 Minuten nach dem letzten PCR-Zyklus bei 70-74 ° C durchgeführt.
• Endgültiger Halt: Dieser Schritt ist optional. Die Temperatur wird bei 4-15 ° C gehalten und die Reaktion wird gestropft.

Das Verfahren ist in drei Stufen unterteilt:

• Exponentielle Amplifikation: Während jedes Zyklus wird das Produkt (das spezifische DNA-Stück, das repliziert wird) verdoppelt.
• Abflachungsstadium: Da die DNA-Polymerase Aktivität verliert und Reagenzien verbraucht, verlangsamt sich die Reaktion.
• Plateau: Es sammelt sich kein Produkt mehr an.