Helicos BioSciences: Heliskop-Sequenzierung durch Synthese

Helicos BioSciences Corporation geht auf eine Veröffentlichung zurück, die im April 2003 in den Proceedings der National Academy of Sciences (PNAS) von Cal Tech Professor und Erstautor Dr. Steve Quake veröffentlicht wurde. Der Artikel beschrieb die vorläufige Entwicklung einer Technik für die Einzelmolekül-DNA-Sequenzierung, die von der Sanger-Methode für die -Sequenzierung-durch-Synthese abgeleitet wurde. Unter Verwendung der neuen Technik wurden Fluoreszenzsignale verwendet, um markierte Nucleotidtriphosphate nachzuweisen, die auf DNA-Matrizen inkorporiert waren, die an einen Quarz-Objektträger gebunden waren.

Trotz der Einschränkungen in Bezug auf Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Größe der erhältlichen Sequenz war die in PNAS beschriebene neue Sequenzierungsmethode neuartig und zeigte genügend Versprechen, um die Risikokapitalisten, die den Professor ansprachen, seine Technologie. Es muss etwas über die Technik gegeben haben, nach der Venture-Investoren gesucht haben, das war eine erste , so ein langjähriger Mitarbeiter und Senior Director of Research, Dr. Timothy Harris … Venture-Investoren don Normalerweise nähern sie sich den Wissenschaftlern, es ist umgekehrt !

Die PNAS-Veröffentlichung wurde am 1. April 2003 veröffentlicht, die erste Finanzierungsrunde für eine neue Gesellschaft wurde am 19. Dezember 2003 eingeleitet, und am 2. Januar 2004 öffnete Helicos seine Türen mit 5 Mitarbeiter, darunter Dr. Harris, Spezialist für Messwissenschaft und Einzelmolekültechnologie. Helicos befindet sich derzeit in Cambridge, MA, USA. Nach zwei Finanzierungsrunden und einem Börsengang am 27. Mai 2007 wird Helicos nun unter NASDAQ: HLCS gehandelt.

Helicos ist spezialisiert auf genetische Analysetechnologien, insbesondere eine True Single-Molecule Sequencing Technologie (tSMS ^TM ) , validiert mit der Sequenzierung der M13 Virusgenom wie im Science Magazine im April 2008 beschrieben. Die spezialisierte tSMS ^TM -Plattform verwendet den HeliScope ^TM Single Molecule Sequencer .

Laut Dr. Harris wurde dieses spezielle Projekt im Januar 2004 begonnen, und im Juni 2005 hatten sie erfolgreich das M13-Virus sequenziert, eine medizinisch relevante Sequenz, die in dem Science-Artikel beschrieben ist.

Wie funktioniert tSMS ^TM ?

Ein DNA-Strang von etwa 100-200 Basenpaaren wird unter Verwendung von Restriktionsenzymen in kleinere Fragmente geschnitten, und es werden PolyA -Schwänze hinzugefügt. Die verkürzten Stränge werden dann mit der Helicos-Fließzellplatte hybridisiert, an deren Oberfläche Milliarden von polyT -Ketten gebunden sind. Jedes hybridisierte Template wird auf einmal sequenziert. Daher können Milliarden pro Lauf gelesen werden. Die Markierung erfolgt in "Quads" , bestehend aus jeweils 4 Zyklen für jede der 4 Nukleotidbasen.Fluoreszenzmarkierte Basen werden hinzugefügt, und ein Laser im Instrument beleuchtet das Etikett und liest ab, welche Stränge diese bestimmte markierte Basis aufgenommen haben. Das Etikett wird dann gespalten und der nächste Zyklus beginnt mit einer neuen Basis. Nachdem die Flusszelle mit jeder Base (4 Zyklen) behandelt worden ist, ist der Quad fertig und ein neuer beginnt wieder mit der anfänglichen Nukleotidbase.

Derzeit kann das HeliScope ^TM DNA-Fragmente mit einer Länge von etwa 55 Basenpaaren lesen. Je mehr Basen in der Sequenz vorhanden sind, desto geringer ist der Prozentsatz an Strängen, die in einer Probe verwendet werden können, da sich einige Stränge während des Prozesses nicht mehr dehnen.

Für Lesevorgänge mit etwa 20 Basen können etwa 86% der Stränge verwendet werden. Bei längeren Lesevorgängen (55+ Basenpaare) sinkt dieser Prozentsatz auf etwa 50%.

Der Single-Molecule-Vorteil

Während mehrere andere Unternehmen verschiedene Sequencing-by-Synthesis-Technologien mit Hochdurchsatzplattformen, verschiedenen Reagenzien zu vergleichbaren Kosten und für kurze Reads von 25-40 Basenpaaren anbieten, liest nur Helicos die DNA-Sequenz ein Nukleotid auf einmal mit ihrer patentierten Etikettierungstechnik, die empfindlich genug ist, um auf einem einzigen Molekül lesen zu können. Andere Verfahren erfordern, dass die DNA amplifiziert wird (unter Verwendung von PCR), um mehrere (Millionen) Kopien vor der Sequenzierung herzustellen. Es führt das Potential für eine signifikante Ungenauigkeit aufgrund von Verarbeitungsfehlern durch Polymerase-Enzyme während der Amplifikation ein.

Ab April 2008 war das HeliScopeTM Berichten zufolge in der Lage, Milliarden von Nukleotidbasen pro Tag zu sequenzieren.

Helicos ist Mitglied der Personalized Medicine Coalition und hat "$ 1000 genome" Zuschuss erhalten. Das $ 1000-Genom an einem Tag ist ein projiziertes Ziel, für das der Sequenzer Milliarden von Basen pro Stunde verarbeiten müsste. Derzeit würde der Prototyp-Sequenzer Jahre benötigen, um ein gesamtes Genom zu identifizieren, was viel mehr als 1000 US-Dollar kosten würde.

Die Anwendungen für die tSMSTM-Technologie sind zahlreich, einschließlich des Nachweises von genetischen Varianten bei Menschen und anderen Spezies zur Bestimmung von Krankheitsursachen, Antibiotikaresistenz bei Bakterien, Virilität bei Viren und mehr. Die Fähigkeit, ein einzelnes Gen ohne Amplifikation nachzuweisen, hat viele potentielle Verwendungen in der Umweltmikrobiologie, da genetische Techniken häufig verwendet werden, um lebensfähige, nicht kultivierbare Mikroorganismen nachzuweisen, oder solche, die in Böden und anderen Matrices gefunden werden, die die Isolation durch aktuelle Verfahren verhindern. Darüber hinaus bereitet die Natur von Umweltproben aufgrund von Verunreinigungsproblemen häufig Schwierigkeiten bei der Genamplifikation mittels PCR. Diese Schwierigkeiten müssten jedoch auch überwunden werden, damit die in tSMSTM verwendeten Polymeraseenzyme störungsfrei funktionieren.

Die Theorie hinter der Einzelmolekül-Sequenzierung ist ziemlich einfach, und Sie wundern sich vielleicht, warum noch niemand daran gedacht hat. Obwohl es einfach genug klingt, gibt es viele technische Komponenten bei der Entwicklung solcher Plattformen und viele Herausforderungen, um Helicos beschäftigt zu halten, einschließlich der Entwicklung neuer chemischer Reaktionen und Reagenzien, Platten und Hochdurchsatz-Lesegeräte.Die Fähigkeit, Fluoreszenz eines einzelnen Etiketts auf einer einzigen Basis zu detektieren, erfordert hochempfindliche Instrumente , und die Chemie zum Markieren und Detektieren von Signalen muss genau richtig sein, um Störungen zu minimieren und die Wiedergabetreue zu optimieren die DNA-Polymerase, wie sie auf immobilisierte Template und markierte Nukleotide angewendet wird. Dies sind einige der Herausforderungen, mit denen Helicos bei der Entwicklung dieser Technologie konfrontiert ist, in der Hoffnung, eines Tages das 1.000-tägige menschliche Genom liefern zu können.