Verfahren zur Proteinreinigung

Ein wichtiger Teil der biotechnologischen Forschung ist die Verwendung von Protein-Engineering-Techniken, um Proteine ​​mit optimierten Eigenschaften für spezifische industrielle Anwendungen zu entwerfen oder zu modifizieren. Dazu muss der Wissenschaftler in der Lage sein, interessierende Proteine ​​zu isolieren und zu reinigen, damit ihre Konformationen, Substratspezifitäten, Reaktionen mit anderen Liganden und spezifische Aktivitäten untersucht werden können.

Der Grad der erforderlichen Proteinreinheit hängt von der beabsichtigten Endanwendung des Proteins ab.

Für einige Anwendungen ist ein Rohextrakt ausreichend. Für andere Verwendungen, wie in Nahrungsmitteln und Pharmazeutika, ist jedoch ein hoher Reinheitsgrad erforderlich. Um dies zu erreichen, werden typischerweise mehrere Proteinreinigungsverfahren in einer Reihe von Reinigungsschritten verwendet.

Jeder Proteinreinigungsschritt führt normalerweise zu einem gewissen Grad an Produktverlust. Daher ist eine ideale Proteinreinigungsstrategie eine, bei der der höchste Reinigungsgrad in den wenigsten Schritten erreicht wird. Die Auswahl der zu verwendenden Schritte hängt von der Größe, Ladung, Löslichkeit und anderen Eigenschaften des Zielproteins ab. Die folgenden Techniken sind am geeignetsten für die Reinigung eines einzelnen cytosolischen Proteins. Die Reinigung von cytosolischen Proteinkomplexen ist komplizierter und erfordert üblicherweise die Anwendung verschiedener Methoden.

Erste Schritte zur Proteinaufreinigung

Der erste Schritt bei der Aufreinigung von intrazellulären (innerhalb der Zelle) Proteinen ist die Herstellung eines Rohextraktes .

Der Extrakt enthält eine komplexe Mischung aller Proteine ​​aus dem Zellzytoplasma und einige zusätzliche Makromoleküle, Kofaktoren und Nährstoffe. Rohextrakt kann für einige Anwendungen in der Biotechnologie verwendet werden, wenn jedoch Reinheit ein Problem ist, müssen nachfolgende Reinigungsschritte befolgt werden. Roheiweißextrakte werden durch Entfernung von Zelltrümmern hergestellt, die durch Zelllyse erzeugt werden, was unter Verwendung von Chemikalien und Enzymen, Beschallung oder einer French Press erreicht wird.

Der Rückstand wird durch Zentrifugation entfernt und der Überstand wird zurückgewonnen. Rohe Präparationen von extrazellulären Proteinen können durch einfaches Entfernen der Zellen durch Zentrifugation erhalten werden.

Für bestimmte biotechnologische Anwendungen besteht eine Nachfrage nach thermostabilen Enzymen : Enzyme, die hohe Temperaturen ohne Denaturierung tolerieren können und dabei eine hohe spezifische Aktivität beibehalten. Organismen, die sie produzieren, werden manchmal als Extremophile bezeichnet. Ein einfacher Ansatz zur Reinigung eines hitzebeständigen Proteins besteht darin, die anderen Proteine ​​in der Mischung durch Erhitzen zu denaturieren, dann die Lösung zu kühlen (wodurch sich das thermostabile Enzym gegebenenfalls wieder bilden oder wieder auflösen kann. Die denaturierten Proteine ​​können dann durch Zentrifugation entfernt werden).

Intermediate Purification Steps

In der Vergangenheit war ein gewöhnlicher zweiter Schritt zur Reinigung eines Proteins aus einem Rohextrakt durch Präzipitation in einer Lösung mit hoher osmotischer Stärke (d. H.e. Salzlösungen). Nukleinsäuren im Rohextrakt können durch Ausfällen von Aggregaten, die mit Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat gebildet wurden, entfernt werden. Die Proteinfällung wird gewöhnlich unter Verwendung von Ammoniumsulfat als Salz durchgeführt.

Verschiedene Proteine ​​werden in verschiedenen Konzentrationen von Ammoniumsulfat präzipitieren.

Im Allgemeinen präzipitieren Proteine ​​mit höherem Molekulargewicht in niedrigeren Konzentrationen von Ammoniumsulfat. Die Salzfällung führt normalerweise nicht zu einem hochgereinigten Protein, kann aber dazu beitragen, einige unerwünschte Proteine ​​in einer Mischung zu eliminieren und die Probe zu konzentrieren. Salze in der Lösung werden dann durch Dialyse durch poröse Celluloseschlauch-, Filtrations- oder Gelausschlußchromatographie entfernt.

Moderne Biotech-Protokolle nutzen oft die vielen kommerziell verfügbaren Kits, die vorgefertigte Lösungen für Standardverfahren bereitstellen. Die Proteinreinigung wird oft unter Verwendung von Filtern und vorbereiteten Gelfiltrationssäulen durchgeführt. Alles, was Sie tun müssen, ist, den Anweisungen zu folgen und das richtige Volumen der richtigen Lösung zuzugeben und die angegebene Zeitspanne zu warten, während Sie das Eluat (das am anderen Ende der Säule austritt) in einem frischen Reagenzglas sammeln.

• Chromatographische Methoden können unter Verwendung von Tischsäulen oder automatisierten HPLC-Geräten angewendet werden. Die Trennung durch HPLC kann durch Umkehrphasen-, Ionenaustausch- oder Größenausschlussverfahren und durch Diodenarray- oder Lasertechnologie erfasste Proben durchgeführt werden.

  Proteinvisualisierung und Beurteilung der Reinigung

  • Umkehrphasenchromatographie (RPC) trennt Proteine ​​basierend auf ihren relativen Hydrophobizitäten . Diese Technik ist sehr selektiv, erfordert jedoch die Verwendung organischer Lösungsmittel. Einige Proteine ​​werden durch Lösungsmittel permanent denaturiert und verlieren ihre Funktionalität während der RPC. Daher wird diese Methode nicht für alle Anwendungen empfohlen, insbesondere wenn es notwendig ist, dass das Zielprotein Aktivität behält.
  • Ionenaustauschchromatographie bezieht sich auf die Trennung von Proteinen auf der Basis von Ladung . Säulen können entweder für Anionenaustausch oder Kationenaustausch vorbereitet werden. Anionenaustausch-Säulen enthalten eine stationäre Phase mit einer positiven Ladung, die negativ geladene Proteine ​​anzieht. Kationenaustausch -Säulen sind die umgekehrten, negativ geladenen Kügelchen, die positiv geladene Proteine ​​anziehen. Die Elution des Zielproteins (der Zielproteine) erfolgt durch Änderung des pH-Werts in der Säule, was zu einer Änderung oder Neutralisierung der geladenen funktionellen Gruppen jedes Proteins führt.
  • Größenausschlusschromatographie ( Gelfiltration ) trennt größere Proteine ​​von kleinen, da die größeren Moleküle schneller durch das vernetzte Polymer in der Chromatographiesäule wandern. Die großen Proteine ​​passen nicht in die Poren des Polymers, wohingegen kleinere Proteine ​​länger brauchen, um durch die Chromatographiesäule über ihren weniger direkten Weg zu reisen. Eluat wird in einer Reihe von Röhrchen gesammelt, die Proteine ​​basierend auf der Elutionszeit trennen. Die Gelfiltration ist ein nützliches Werkzeug zum Konzentrieren einer Proteinprobe, da das Zielprotein in einem kleineren Elutionsvolumen gesammelt wird, als anfänglich zu der Säule gegeben wurde.Ähnliche Filtrationstechniken könnten aufgrund ihrer Kosteneffektivität bei der Produktion von großtechnischem Protein verwendet werden.
  • Affinitätschromatographie ist eine sehr nützliche Technik zum "Polieren" oder Vervollständigen des Proteinreinigungsprozesses. Kügelchen in der Chromatographiesäule werden mit Liganden vernetzt, die spezifisch an das Zielprotein binden. Das Protein wird dann durch Spülen mit einer Lösung, die freie Liganden enthält, von der Säule entfernt. Diese Methode liefert die reinsten Ergebnisse und die höchste spezifische Aktivität im Vergleich zu anderen Techniken.
• SDS-PAGE ist eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese, die in Gegenwart von SDS (Natriumdodecylsulfat) durchgeführt wird, das an Proteine ​​bindet und ihnen eine große negative Nettoladung verleiht. Da die Ladungen aller Proteine ​​ziemlich gleich sind, trennt diese Methode sie fast vollständig nach der Größe. SDS-PAGE wird häufig verwendet, um die Reinheit von Protein nach jedem Schritt in einer Reihe zu testen. Wenn unerwünschte Proteine ​​allmählich aus der Mischung entfernt werden, wird die Anzahl der auf dem SDS-PAGE-Gel visualisierten Banden reduziert, bis nur eine Bande das gewünschte Protein darstellt.
• Immunoblotting ist eine Proteinvisualisierungstechnik, die in Kombination mit Affinitätschromatographie angewendet wird. Antikörper für ein spezifisches Protein werden als Liganden auf einer Affinitätschromatographiesäule verwendet. Das Zielprotein wird auf der Säule zurückgehalten und dann durch Spülen der Säule mit einer Salzlösung oder anderen Mitteln entfernt. Antikörper, die an radioaktive oder Farbstoffmarkierungen gebunden sind, unterstützen den Nachweis des Zielproteins, sobald es vom Rest der Mischung abgetrennt ist.

Quellen:

Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA.

Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, USA. // www. biochemisch uiowa. edu / donelson / Datenbank% 20items / protein_purification_handbook. pdf.